Resumen La nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenililtransferasa (NMNAT, EC 2.7.7.1/18) desempeña una función central en la síntesis del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD) debido a que en esta enzima confluyen las rutas de síntesis de novo y de reciclaje. El NAD es una molécula trascendental en el metabolismo de todos los seres vivos, principalmente en el metabolismo redox. En este estudio se presenta una nueva estrategia metodológica para la evaluación de posibles inhibidores de la NMNAT de Leishmania braziliensis (LbNMNAT). El método suprime la actividad inhibitoria cruzada con la enzima acoplada al ensayo de detección, la alcohol dehidrogenasa (ADH, EC 1.1.1.1). Experimentalmente se introdujo un paso intermedio de extracción en fase sólida de los inhibidores antes de la ejecución del sistema enzimático de detección. La implementación del paso de extracción posibilitó la evaluación específica de la enzima de interés, la LbNMNAT, sin afectar la enzima acoplada ADH. El nuevo método permitió estudiar el efecto inhibitorio de la galotanina, producto natural de especies del género Rhus (Rhus chinensis), en la actividad de la LbNMNAT.

Abstract The enzyme nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC 2.7.7.1/18) plays a central role in the nicotinamide and adenine dinucleotide (NAD) synthesis as its de novo and salvage pathways converge in it. NAD is a crucial molecule in the metabolism of all living beings, mainly in redox metabolism. Here we describe a new methodological strategy for the evaluation of possible inhibitors of Leishmania braziliensis NMNAT (LbNMNAT). Our method suppresses the cross inhibitory activity of the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH, EC 1.1.1.1) coupled to the detection assay. We improved the specificity of the coupled enzymatic system, by introducing an additional solid-phase extraction step of the inhibitors prior to the execution of the coupled detection system. This step enabled the differentiated evaluation of the LbNMNAT activity without interfering in the coupled ADH enzyme, as well as the assessment of the inhibitory activity of gallotannin, an inhibitor found in Rhus chinensis, on LbNMNAT.

Resumen Los sistemas de defensa anti-oxidante utilizados por el parásito intracelular Leishmania braziliensis durante el proceso de infección permiten eliminar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno a expensas de equivalentes reductores derivados de la tripanotiona, evitando daños celulares del patógeno. Con el objetivo de identificar potenciales blancos moleculares para el desarrollo de fármacos contra este parásito, se realizó la detección de la enzima triparedoxina peroxidasa citoplasmática de L. braziliensis (LbTXNPxII), la cual es esencial para disminuir concentraciones tóxicas de peróxido de hidrógeno en el contexto de infección. Para esto se generaron anticuerpos policlonales en modelo aviar, partiendo de la clonación, expresión y purificación de la proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) en el sistema heterólogo Escherichia coli. La proteína purificada se utilizó como antígeno para la producción de anticuerpos IgY, cuya implementación en estudios in situ permitió detectar y localizar la enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) en el citoplasma de promastigotes fijados y verificar su interacción molecular con la nicotinamida/ nicotinato mononucleótido adenilil transferasa, enzima involucrada en la síntesis del NAD. De este modo, se reporta el desarrollo de una herramienta bioquímica para la identificación y estudio de la enzima LbTXNPxII y su participación en vías del metabolismo energético y de defensa anti-oxidante.

Abstract The antioxidant defense systems used by the intracellular parasite Leishmania braziliensis during the infection process make it possible to eliminate reactive oxygen and nitrogen species at the expense of reducing equivalents derived from trypanothione, avoiding cellular damage of the pathogen. In order to identify potential molecular targets for the development of drugs against this parasite, the cytoplasmic tryparedoxin peroxidase of L. braziliensis (LbTXNPxII), which is essential to reduce toxic concentrations of hydrogen peroxide in the context of infection, was carried out. In this regard, polyclonal antibodies were generated in an avian model, starting from the cloning, expression, and purification of the recombinant protein 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) in the heterologous system of Escherichia coli. The purified protein was used as an antigen for the production of IgY antibodies, whose implementation in in situ experiments allowed the detection and localization of the endogenous LbTXNPxII enzyme (22kDa) in the cytoplasm of fixed promastigotes, as well as the verification of its molecular interaction with nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase, an enzyme involved in the synthesis of NAD. Thus, the development of a biochemical tool for the identification and study of the LbTXNPxII enzyme and its participation in energy metabolism and antioxidant defense pathways is reported.

Resumo Os sistemas de defesa antioxidante utilizados pelo parasita intracelular Leishmania braziliensis durante o processo de infecção, permitem a eliminação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio em detrimento de equivalentes redutores derivados de tripanotiona, evitando o dano celular do patógeno. Com o objetivo de identificar potenciais alvos moleculares para o desenvolvimento de drogas contra esse parasita, foi detectada a enzima citoplasmática triparedoxina peroxidase de L. braziliensis (LbTXNPxII), essencial para reduzir as concentrações tóxicas de peróxido de hidrogênio no contexto de infecção. Para isso, anticorpos policlonais foram gerados em modelo aviário, a partir da clonagem, expressão e purificação da proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) no sistema heterólogo de Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada como antígeno para a produção de anticorpos IgY, cuja implementação em experimentos in situ permitiu a detecção e localização da enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) no citoplasma de promastigotas fixos e verificar sua interação molecular com nicotinamida/nicotinato mononucleotídeo adenililtransferase, enzima envolvida na síntese de NAD. Assim, é relatado o desenvolvimento de uma ferramenta bioquímica para a identificação e estudo da enzima LbTXNPxII e sua participação no metabolismo energético e nas vias de defesa antioxidante.

Resumen El parásito intracelular Leishmania braziliensis es el agente causal de la leishmaniasis cutánea, enfermedad endémica de zonas tropicales, cuyos tratamientos farmacológicos son tóxicos y para la cual no se dispone de una vacuna en la actualidad. Por esta razón, el estudio de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético del parásito es relevante dada su importancia para la supervivencia del mismo. En este estudio, utilizando como secuencia plantilla los primeros 18 residuos del extremo N-terminal de la proteína nicotinamida/ nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de L. braziliensis (Lb-NMNAT), se sintetizaron péptidos implementando la estrategia Fmoc/ tert-Butilo en una resina Rink amida MBHA. Los péptidos se purificaron por cromatografía en columna C18 y se caracterizaron mediante RP-HPLC. La proteína recombinante 6xHisLb-NMNAT se expresó en células Escherichia coli M15 y se purificó parcialmente empleando cromatografía de afinidad a metales inmovilizados. De esta proteína se confirmó su actividad enzimática a través de ensayos enzimáticos directos analizados por RP-HPLC. Los péptidos sintetizados se utilizaron para evaluar su efecto sobre la actividad enzimática de la proteína 6xHisLb-NMNAT, observándose una modulación diferencial, lo cual resulta promisorio para el diseño de herramientas quimioterapéuticas basadas en la secuencia N-terminal de la proteína Lb-NMNAT.

Abstract The intracellular parasite Leishmania braziliensis is the etiological agent of cutaneous leishmaniasis, an endemic disease in the tropics, whose pharmacological treatments are toxic and for which there is currently no vaccine. For this reason, the study of proteins related to the energy metabolism of the parasite is relevant given its importance for its survival. In this study, based on the first 18 residues of the N-terminal end of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyl transferase protein from L. braziliensis (Lb-NMNAT) as a template, peptides were synthesized implementing the Fmoc/tert-Butyl strategy in a Rink amide MBHA resin. The peptides were purified by C18 column chromatography and characterized by RP-HPLC. The recombinant 6xHisLb-NMNAT protein was expressed in Escherichia coli M15 cells and partially purified using immobilized metal affinity chromatography. The enzymatic activity of the protein was confirmed through direct enzymatic assays analyzed by RP-HPLC. The synthesized peptides were used to evaluate their effect on the enzymatic activity of the 6xHisLb-NMNAT protein, observing a differential modulation, which is promising for the design of chemotherapeutic tools based on the N-terminal sequence of the Lb-NMNAT protein.

Resumo O parasita intracelular Leishmania braziliensis é o agente causador da leishmaniose tegumentar, doença endêmica nos trópicos, cujos tratamentos farmacológicos são tóxicos e para a qual não existe vacina atualmente. Por este motivo, o estudo de proteínas relacionadas ao metabolismo energético do parasita é relevante dada a sua importância para a sua sobrevivência. Neste estudo, usando os primeiros 18 resíduos da extremidade N-terminal da proteína adenilil transferase de nicotinamida/mononucleotídeo nicotinato de L. braziliensis (Lb-NMNAT) como uma sequência modelo, os peptídeos foram sintetizados implementando a estratégia Fmoc/tert-Butil em uma resina Rink amida MBHA. Os peptídeos foram purificados por cromatografia em coluna C18 e caracterizados por RP-HPLC. A proteína recombinante 6xHisLb-NMNAT foi expressa em células de Escherichia coli M15 e parcialmente purificada usando cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Desta proteína, sua atividade enzimática foi confirmada por meio de ensaios enzimáticos diretos analisados por RP-HPLC. Os peptídeos sintetizados foram utilizados para avaliar seu efeito na atividade enzimática da proteína 6xHisLb-NMNAT, observando uma modulação diferencial, o que é promissor para o projeto de ferramentas quimioterápicas baseadas na sequência N-terminal da proteína Lb-NMNAT

Resumen El dinucleótido de adenina y nicotinamida fosfato (NADP) es una biomolécula esencial que participa en la homeostasis redox y en la síntesis de compuestos de señalización. La única enzima capaz de sintetizar NADP es la NAD Quinasa (NADK, EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86). En este estudio se presenta un acercamiento al metabolismo del NADP en el parásito Giardia intestinalis, agente etiológico de la giardiasis, una enfermedad de alta prevalencia en América, África y Asia. Mediante herramientas bioinformáticas se identificó un candidato a NADK, cuya predicción a nivel de estructura terciaria mostró motivos característicos y universales de NADKs previamente caracterizadas. La proteína recombinante correspondiente (His-GINADK) se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) y se purificó parcialmente mediante cromatografía de afinidad a níquel. La síntesis de NADP por parte de la proteína His-GINADK se comprobó mediante ensayos enzimáticos evaluados por RP-HPLC. Adicionalmente, se determinó una localización subcelular citosólica en trofozoítos del parásito, empleando inmunofluorescencia indirecta y anticuerpos policlonales producidos en modelos murinos inmunizados con la proteína His-GINADK purificada a partir de cuerpos de inclusión. Los resultados obtenidos representan un avance en el entendimiento del metabolismo del NADP y de la importancia fisiológica de la NADK en el modelo de Giardia.

Abstract Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) is an essential biomolecule that participates in the redox homeostasis and synthesis of signaling compounds. NAD kinase (NADK) (EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86) is the only enzyme capable of synthesizing NADP. This study offers an approach to the NADP metabolism in the parasite Giardia intestinalis, the etiological agent of giardiasis, a disease of high prevalence in America, Asia and Africa. Through bioinformatics tools a NADK enzyme candidate was identified, whose tertiary structure modeling demonstrated distinctive and universal motifs of characterized NADKs. The corresponding recombinant protein (His-GINADK) was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and its partial purification was achieved by nickel affinity chromatography. Functional identification, which showed NADP synthesis, was completed through enzymatic assays evaluated by RP-HPLC. A cytosolic localization of the endogenous GINADK enzyme was observed in trophozoites throughout indirect immunofluorescence analysis, using polyclonal antibodies produced in mice by its immunization with the His-GINADK protein, purified from inclusion bodies. Taken together, our results contribute to the understanding of the NADP metabolism and the physiological role of NADK in the Giardia model.

Resumo A nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) é uma biomolécula essencial que participa na homeostase redox e na síntese de importantes compostos de sinalização. A NAD quinase (NADK) (EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86) é a única enzima capaz de sintetizar o NADP. Este estudo apresenta uma abordagem do metabolismo do NADP no parasita Giardia intestinalis que causa giardíase, uma doença de alta prevalência na América, Ásia e África. Através de ferramentas de bioinformática, um candidato a enzima NADK foi identificado no parasita, cuja modelagem de estrutura terciária, demonstra motivos distintos e universais de NADKs caracterizadas. A correspondente proteína recombinante (His-GINADK) foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) e a sua purificação parcial foi conseguida por cromatografia de afinidade com níquel. A identificação funcional, que mostrou a síntese de NADP, foi completada através de ensaios enzimáticos avaliados por RP-HPLC. Uma localização citosólica da enzima GINADK endógena foi observada em trofozoítos ao longo da análise de imunofluorescência indireta, utilizando anticorpos policlonais produzidos em camundongos, imunizados com a proteína His-GINADK purificada de corpos de inclusão. Em conjunto, nossos resultados contribuem para a compreensão do metabolismo do NADP e da importância fisiológica do NADK no modelo de Giardia.

BACKGROUND Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) plays a central role in energy metabolism and integrates cellular metabolism with signalling and gene expression. NAD biosynthesis depends on the enzyme nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT; EC: 2.7.7.1/18), in which converge the de novo and salvage pathways. OBJECTIVE The purpose of this study was to analyse the protein-protein interactions (PPI) of NMNAT of Leishmania braziliensis (LbNMNAT) in promastigotes. METHODS Transgenic lines of L. braziliensis promastigotes were established by transfection with the pSP72αneoαLbNMNAT-GFP vector. Soluble protein extracts were prepared, co-immunoprecipitation assays were performed, and the co-immunoprecipitates were analysed by mass spectrometry. Furthermore, bioinformatics tools such as network analysis were applied to generate a PPI network. FINDINGS Proteins involved in protein folding, redox homeostasis, and translation were found to interact with the LbNMNAT protein. The PPI network indicated enzymes of the nicotinate and nicotinamide metabolic routes, as well as RNA-binding proteins, the latter being the point of convergence between our experimental and computational results. MAIN CONCLUSION We constructed a model of PPI of LbNMNAT and showed its association with proteins involved in various functions such as protein folding, redox homeostasis, translation, and NAD synthesis.

The biochemical pathways involved in nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) biosynthesis converge at the enzymatic step catalysed by nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC: 2.7.7.1). The majority of NMNATs are assembled into homo-oligomeric states that comprise 2-6 subunits. Recently, the NMNAT of Plasmodium falciparum (PfNMNAT) has been identified as a pharmacological target. The enzymatic characterisation, cellular location, and tertiary structure of the PfNMNAT protein have been reported. Nonetheless, its quaternary structure remains to be explored. The present study describes the oligomeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT recombinant protein using immobilised metal affinity chromatography coupled with size exclusion chromatography (SEC) and native protein electrophoresis combined with Ferguson plot graphing. These chromatographic approaches resulted in the elution of an active monomer from the SEC column, whereas the Ferguson plot indicated a dimeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT protein.

Nicotinamide/nicotinate adenine dinucleotide (NAD+/NaAD) performs essential functions in cell metabolism and energy production due to its redox properties. The nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC 2.7.7.1/18) enzyme catalyses the key step in the biosynthesis of NAD+. Previously, the enzyme NMNAT was identified in Trypanosoma cruzi (TcNMNAT), a pathogenic agent with epidemiological importance in Latin America. To continue with the functional characterisation of this enzyme, its subcellular location and its possible post-translational modifications were examined in this study. For this, polyclonal antibodies were generated in mice, with soluble and denatured recombinant protein being used to detect the parasite’s NMNAT. Immunodetection assays were performed on whole extracts of T. cruzi, and an approximation of its intracellular location was determined using confocal microscopy on wild and transgenic parasites, which revealed the cytosol distribution patterns. This localisation occurs according to the needs of the dinucleotides that exist in this compartment. Additionally, a bioinformatics study was performed as a first approach to establish the post-translational modifications of the enzyme. Possible phosphorylation events were experimentally analysed by western blot, highlighting TcNMNAT as a potential target for serine kinases.